ELYSIUM
TÉCNICA HISTOLÓGICA
INTRODUCCIÓN.
Sería maravilloso que para conocer la estructura morfológica microscópica de una célula y deducir, en lo posible sus funciones, bastara con examinarlas a través de los instrumentos que amplían imágenes de los objetos observados, desgraciadamente este procedimiento no es factible; pues al intentar hacerlo se presentan serias dificultades en la manipulación de los especimenes y el inicio de los procesos propios de desarreglo molecular después que las células y los tejidos abandonan su hábitat natural. Por lo tanto, es necesario utilizar una serie de procedimientos y artificios que nos permitan describir, comprender y analizar la estructura microscópica de las células, tejidos y órganos.
Se denomina TÉCNICA HISTOLOGICA al conjunto de procedimientos aplicados a un material biológico (animal o vegetal) con la finalidad de prepararlo y conferirle las condiciones óptimas para poder observar, examinar y analizar sus componentes morfológicos a través del microscopio.
PROCEDIMIENTOS INMEDIATOS O VITALES
Permiten la observación y el estudio de protozoarios, Células sanguíneas, células descamadas o disociadas, células en cultivo de tejidos; estructuras muy delgadas y translúcidas como la membrana peritoneal de animales pequeños o epidermis de vegetales, granos de polen etc. suspendidas en los líquidos de su hábitat natural o solución salina balanceada. Para una observación óptima suele utilizarse tipos especiales de microscopios fotónicos como el de campo oscuro o el de contraste de fases: observación al estado fresco.
PROCEDIMIENTOS MEDIATOS O POSTVITALES
Tienen por finalidad preparar células, tejidos y órganos procedentes de seres en los que los procesos vitales se han detenido y es necesario conservar la estructura que tenían en vida. De manera general, para alcanzar este objetivo es ecesario realizar los siguientes pasos:
- Toma de la muestra
- Fijación
- Inclusión
- Microtomía
- Coloración o tinción
- Montaje
I. TOMA DE LA MUESTRA
Existen diversos procedimientos que permiten obtener muestras de tejidos y órganos para conseguir preparaciones histológicas de buena calidad. Estos son:
a) Biopsia: (del griego bios = vida y opsis = visión), consiste en la toma de un fragmento de tejido u órgano de un ser vivo. realiza a través de una operación quirúrgica o durante la intervención quirúrgica efectuada en pacientes y corroborar así un diagnóstico de una determinada lesión. La biopsia puede Aer: incisional, excisional, por sacabocados, por punción y absorción, por raspado, por trepanación.
b) Necropsia, las muestras se obtienen de seres muertos: En este caso es recomendable que los tejidos y órganos se obtengan inmediatamente después de producida la muerte.
Recomendaciones: se secciona usando bisturís nuevos, sin hacer presión sobre ellos. El tamaño de las muestras no debe exceder de 10 mm por lado con un grosor de 5 mm.
II. FIJACIÓN.
Es un procedimiento cuya finalidad, al aplicarlo es detener la vida de las células e impedir las modificaciones post morten que pueda sufrir la célula (procesos autolíticos), manteniendo la estructura morfológica de células y tejidos sin que ocurran cambios notables en ellos.
Esto se consigue inmovilizando (por coagulación o precipitación) las moléculas proteínicas e inhibiendo principalmente las enzimáticas haciéndolas insolubles, posibilitan una mejor aplicación de las sustancias colorantes, por ejemplo: el alcohol etílico absoluto conserva el glucógeno.
Los fijadores son:
a) Gaseosos: como el formaldehído.
b) Líquidos: como el ácido acético, al alcohol etílico.
c) Sólidos: como el bicloruro de mercurio.
-Condiciones de un buen fijador.
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Matar inmediatamente a las células, impidiendo la aparición de los procesos autolíticos. Para tal fin el fijador debe poseer: Un buen poder de penetración, que en contados instantes se introduzca con rapidez en el espesor de la muestra y un buen poder de difusión, que alcance las porciones más profundas de la misma.
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Producir cierta dureza a los tejidos sin que se provoque excesiva retracción o hacerlos quebradizos y friables.
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Debe de ser de fácil manipulación.
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No debe disolver componentes celulares.
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Que sea fácil de conseguir y que sea barato.
Formol o formalina. Está considerado como la sustancia fijadora de mayor uso en los laboratorios que realizan técnica histológica. El formol comercial consiste en una solución acuosa del gas formaldehido al 39 - 40%.
CRITERIOS PARA OBTENER UNA BUENA
FIJACIÓN.
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Elección del fijador. La solución fijadora a utilizar depende del estudio que se quiere realizar.
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El tiempo de fijación de las muestras debe ser de 24 a 48 horas como mínimo y si es posible, en refrigeración.
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Tamaño de las muestras. El tamaño y grosor de las muestras deben ser pequeñas y delgadas, de 1cm a 2 cm cuadrados y con un espesor de 2 mm a 5 mm, especialmente si se emplean fijadores con escaso poder de penetración y de difusión.
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Volumen del fijador. Una proporción que es necesario emplear será de 1 a 20 (muestra – fijador).
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Tiempo de fijación. Fijar inmediatamente después de obtenidas mediante una biopsia o que la necropsia se efectúe al poco tiempo de producida la muerte.
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Temperatura de la fijación. Es recomendable efectuar la fijación a bajas temperaturas (4°C.) dentro de un refrigerador.
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Almacenamiento de las muestras. Después de eliminar el fijador mediante un “lavado”, se guardan en una solución de alcohol al 70%.
III. INCLUSIÓN.
Los tejidos se infiltran con sustancias denominadas “de inclusión” y adquieran tal dureza que sometidos al filo de una navaja produzcan secciones, cortes o láminas sumamente delgados y transparentes.
Las sustancias de inclusión tienen la propiedad de incorporarse e infiltrarse al interior de las células y tejidos con la finalidad de servirles de soporte, formando un bloque homogéneo en dureza y consistencia, a pesar que sus componentes tuvieron originalmente distinta dureza.
Inclusión en parafina.
Los pasos a seguir para la inclusión de las muestras en parafina son:
a) Deshidratación
b) Impregnación en el solvente (diafanización)
c) Inclusión y formación del bloque de parafina
a) Deshidratación. Remover el agua de los tejidos fijados, se utilizan líquidos deshidratadores en los cuales se sumergen los tejidos, son el alcohol etílico o isopropílico.
El procedimiento de rutina es el siguiente:
1) alcohol etílico al 70 % ------------------- 12 horas
2) alcohol etílico al 70 % ------------------- 12 horas
3) alcohol etílico al 95 % --------------------- 1 hora
4) alcohol etílico al 95 % --------------------- 1 hora
5) alcohol etílico al 100 % (absoluto) --------1 hora
6) alcohol etílico al 100 % (absoluto)---------1 a 1.5 horas.
Nota: En cada caso es necesario agitar de vez en cuando los frascos que contienen las muestras
La deshidratación incompleta de los tejidos se comprueba cuando éstos al sumergirse en el líquido diafanizador muestran un aspecto turbio blanquecino
b)Diafanización. La parafina no es soluble en alcohol por lo que es necesario reemplazarlo por sustancias que sean capaces, simultáneamente, de mezclarse con el alcohol y disolver la parafina. Ejemplos: xilol, benceno y el cloroformo.
El líquido diafanizador de uso más frecuente es el xilol
La diafanización de los tejidos deshidratados se debe a que estas sustancias poseen un alto índice de refracción y al interactuar con los tejidos los vuelven transparentes.
El procedimiento de diafanización se realiza de la siguiente manera:
7) alcohol absoluto (50%) - xilol (50%)--------1 hora
8) xilol-----------------------------------------------1 hora
9) xilol-----------------------------------------------1 hora
c) Inclusión y formación del bloque de parafina. Las parafinas son hidrocarburos saturados provenientes de la destilación del petróleo. Generalmente son sustancias sólidas a temperatura ambiente. Las parafinas se clasifican en:
Blandas. (Fusión a 45°). Son recomendables para incluir tejidos en los se detectarán antígenos mediante inmunohistoquímica.
Semiduras. Fusión a 54°). Es la parafina que se emplea con mayor frecuencia en los laboratorios donde se realiza técnica histológica.
Duras. (Fusión a 60°). Son parafinas que deben usarse en ambientes con climas de temperaturas altas.
La parafina diluida se coloca en tres recipientes dentro de la estufa. En el interior de la estufa debe existir otro recipiente conteniendo parafina líquida pura, que se empleará para la formación de los “bloques”.
10) Primer baño de parafina------------------1 a 1.5 horas
11) Segundo baño de parafina----------------1 a 1.5 horas
12) Tercer baño de parafina-----------------30 a 60 minutos
La inclusión o formación del bloque de parafina se efectúa empleando moldes de diversos materiales y diferentes áreas y profundidades. Pueden ser de papel, metal o plástico.
El bloque de parafina debe contener la muestra correctamente orientada.
El molde elegido se llena con parafina caliente pura; se toma una pieza de tejido y se orienta una de sus superficies (aquella que se pondrá en contacto con el filo de la navaja) se sumerge al interior del molde, después los moldes se enfrían de inmediato (se sumergen en agua fría o se introducen en el refrigerador).
IV. MICROTOMIA
Las secciones delgadas o “cortes” se obtienen con instrumentos se denominados “microtomos”, se clasifican de acuerdo a la manera como se desplaza el bloque que contiene el tejido incluido; así, existen:
a) Microtomo de rotación tipo Minot. Mediante una manivela circular denominada volante, el mecanismo que sujeta al bloque de parafina se desplaza frente al filo de la navaja, de arriba hacia abajo y viceversa en un movimiento vertical.
b) Microtomo de deslizamiento. El movimiento que se realiza para obtener los cortes es horizontal, es decir de atrás hacia adelante y viceversa.
Los microtomos tipo Minot permiten obtener secciones 4 a 7micrómetros de espesor. Producen cortes seriados.
Existen dos condiciones indispensables que garantizan la obtención de secciones delgadas, uniformes y seriadas:
a) Que la deshidratación, impregnación e inclusión hayan sido realizadas correctamente.
b) El empleo de una navaja o cuchilla muy bien afilada y asentada y que el filo de la misma ofrezca la inclinación adecuada hacia la superficie del bloque.
V. COLORACIÓN O TINCIÓN.
Consiste en que una estructura celular o tisular adquiere específicamente un color bajo la acción de una sustancia colorante.
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Se considera que una estructura se ha coloreado o teñido cuando al ser lavada con el líquido que disuelve al colorante, no se decolora.
Se denomina sustancia colorante a aquella que puede transferir su color a otro cuerpo.
Existen varios criterios para clasificar a los colorantes:
a) Por su origen.
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Animales. Como el carmín, que se extrae de la cochinilla, artrópodo parásito de los tallos del nopal (tuna). El carmín (de color rojo intenso) es uno de los colorantes naturales más empleado en la industria alimentaria y cosmética.
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Vegetales. Como la hematoxilina, obtenida de la corteza de un árbol, el “palo de campeche” (Haematoxilum campechanum).
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Colorantes artificiales o sintéticos. Productos derivados de la destilación de la hulla o carbón. Genéricamente se les conoce como colorantes derivados de la anilina.
Los colorantes artificiales son sales.
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Ácidos: son sales cuya parte básica es incolora y el componente ácido posee color. Así, en el colorante eosina o eosinato de sodio, la propiedad colorante se debe al ácido eosínico y no a la base, el sodio.
Tienen carga eléctrica negativa, tiñen al grupo químico, cargado eléctricamente, localizado en un extremo de la cadena de aminoácidos que integran las proteínas citoplasmáticas.
Las sustancias que atraen eléctricamente a los colorantes ácidos se denominan “acidófilas” y químicamente están constituidas por componentes básicos o alcalinos.
Ejemplos: la eosina.
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Básicos. Son sales que poseen la base coloreada e incolora la porción ácida; Poseen una carga eléctrica positiva, tienen afinidad por los ácidos nucleicos (ADN y ARN).
Las sustancias teñidas por los colorantes básicos se denominan “basófilas” y están constituidas por componentes ácidos.
Ejemplos: la hematoxilina.
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Neutros. Son sales en las que tanto la parte básica como la parte ácida proporcionan color. Por ejemplo el eosinato de azul de metileno o el eosinato de azur de metileno.
Tiñen de manera simultánea, a los componentes nucleares y a los citoplasmáticos, inclusive pueden proporcionar colores distintos (metacromasia) a determinados componentes citoplasmáticos. Forman parte de las fórmulas colorantes para frotis de sangre (Wright).
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Indiferentes.- No forman sales. Son compuestos no iónicos incapaces de la disociación electrolítica.
Son solubles en las grasas, tiñen selectivamente a los lípidos. Los ejemplos son: El sudán, III y IV.
COLORACION DE HEMATOXILINA -EOSINA (H&E)
Consiste en la tinción de:
a) Núcleos mediante hematoxilina. Los núcleos se colorean de azul, azul morado, violeta, pardo oscuro o negro.
b) El citoplasma y material extracelular utilizando la eosina que les confiere diversos grados de color rosado.
El procedimiento de coloración de H & E es el siguiente:
1. Desparafinar los cortes con xilol 6 minutos
2. Hidratar los cortes en baños decrecientes de alcohol, absoluto 3 minutos (2x), alcohol de 95° 3 minutos (2x), alcohol de 70° por 3 minutos, agua corriente 5 minutos y agua destilada (2 baños) de 1 minuto.
3. Colorear con la solución de hematoxilina. La hematoxilina de uso más frecuente es la hematoxilina alumínica de Harris 3 a 5 minutos
4. Lavado en agua destilada (2 baños) de un minuto cada uno.
5. Diferenciar, para eliminar el exceso de colorante, se emplea el alcohol ácido, hasta que los núcleos y los componentes basófilos de las células sean lo únicos que permanezcan teñidos, se lava en agua corriente por 2 minutos.
6. Virar al color azul, empleando soluciones de sustancias alcalinas como agua amoniacal y se ava en agua corriente 5 minutos y en agua destilada (2 baños ) 1 minuto c/u.
7. Colorear con una solución alcohólica o acuosa de eosina de 3 a 5 minutos
8. Deshidratar en baños crecientes de alcohol etílico, 70° 1 minuto 95° 1 minuto (2x) y de 100° 1 minuto (2x).
9. Diafanizar o aclarar empleando xilol 1 y 2 minutos.
En estas condiciones los tejidos están preparados para
realizar en ellos el montaje.
VI. MONTAJE.
Se debe colocar la muestra en condiciones de protección y de poderlos utilizar infinidad de veces sin que se deterioren.
Este procedimiento consiste en colocar encima del corte coloreado y diafanizado una gota de una sustancia adherente, diluida, generalmente en xilol (resina natural como el bálsamo de Canadá o resinas sintéticas, cuyos índices de refracción son similares a los del vidrio) y encima de ellos, una laminilla cubreobjetos, cuidando que no queden burbujas de aire entre la resina.
A continuación se deja que el xilol se evapore, y la resina adquiera solidez suficiente; para ello las láminas se colocan en una platina caliente (45°) durante 36 horas y estarán listas para ser observadas.
