Microscopía

El estudio detallado de los componentes de células y tejidos animales o vegetales, por el tamaño que poseen, requiere el uso de instrumentos que permitan ampliar muchas veces más la imagen de las estructuras que los constituyen.

El instrumento que fue empleado por los primeros biólogos para estudiar la célula y los tejidos, es el microscopio. El nombre deriva etimológicamente de dos raíces griegas: mikrós, que significa pequeño y skopéoo, que significa observar. Es decir el microscopio es un instrumento que sirve para observar objetos o estructuras pequeñas.

Existen dos tipos de microscopios (de luz):

a) Microscopio fotónico simple o lupa.
b) Microscopio fotónico compuesto.

El microscopio simple o lupa, usa una o más lentes convergentes en un solo sistema óptico. Dependiendo de la curvatura de la superficie pueden ampliar las imágenes desde 5, 8,10, 12, 20 y hasta 50 veces. Forman una imagen de mayor tamaño, derecha y virtual.

Los microscopios fotónicos compuestos que se emplean actualmente tienen sus antecesores en los instrumentos ópticos desarrollados entre 1590 y 1610, por Hans (padre) y Zacarías (hijo) Janssen.

Se denominan compuestos porque la imagen se forma
mediante tres sistemas de lentes, convergentes y divergentes ( el condensador, los objetivos y los oculares).

COMPONENTES DEL MICROSCOPIO FOTÓNICO.

El microscopio fotónico compuesto esta integrado por tres tipos de componentes:

A) COMPONENTES MECÁNICOS:

Sirven de sostén, movimiento y sujeción de los sistemas ópticos y de iluminación así como de los objetos que se van a observar.

Base o pié. Es un soporte metálico, amplio y sólido en donde se apoyan y sostienen los otros componentes del microscopio.

Brazo. Permite la sujeción y traslado del microscopio. Soporta al tubo óptico, a la platina y el revolver.

Platina. Superficie plana de posición horizontal que posee una perforación circular central. En ella se apoya la preparación que se sujeta a la platina mediante pinzas, con un carrito que mediante mandos especiales facilitan el movimiento de la preparación de derecha a izquierda y de adelante hacia atrás.

Tubo óptico. Consiste en un cilindro metálico que un extremo, está conectado al revolver y en el otro se relaciona con el (los) ocular(es).

Revolver o portaobjetivos. Es un componente que gira alrededor de un eje con la finalidad que los objetivos que sostiene coincidan de manera perpendicular con la perforación central de la platina. Posee varios agujeros donde se atornillan los objetivos.

Tornillos macrométrico y micrométrico. El macrométrico produce desplazamientos evidentes y rápidos de la platina, el micrométrico produce movimientos imperceptibles de la platina y sirve para efectuar el enfoque fino y definitivo de la imagen.

Cabezal. Situado en relación con el tubo del microscopio que alberga principalmente prismas o espejos que sirven para acondicionar en él dos o más oculares, o sistemas mecánicos que soportan cámaras fotográficas, de vídeo o sistemas de proyección de la imagen.

B) COMPONENTES ÓPTICOS:

Son los objetivos, los oculares, el condensador y los prismas. Los tres primeros están constituidos por sistemas de lentes positivos y negativos.

Condensador:
Función principal concentrar y regular los rayos luminosos que provienen de la fuente luminosa, formado por una o dos lentes convergentes, tiene incorporado un diafragma iris que regula la entrada de luz.
Objetivos.
Son los elementos más importantes en la formación de la imagen microscópica, establecen la calidad de la imagen en cuanto a su nitidez y la capacidad que tiene para captar los detalles de la misma (poder de resolución).
Las lentes se disponen dentro de un soporte o camiseta de metal, en cuyo exterior están inscritas una serie de anotaciones numéricas que indican, el aumento propio del objetivo, la apertura numérica, el tipo de material con que están tallados las lentes (de fluorita o semiapocromáticos) o la calidad que tendrán las imágenes, al anularse en la construcción de los objetivos, algunas aberraciones de las lentes (acromáticos, apocromáticos, aplanáticos etc.) o si se debe usar alguna sustancia de inmersión.
Se tienen objetivos con aumentos propios de , 4x, 10x, 40x y 100x. Son objetivos secos (existe aire), de inmersión (requieren una sustancia líquida).

La capacidad que tienen los objetivos de formar imágenes en donde se distingan más detalles del objeto examinado depende de una serie de factores como los que se mencionan a continuación:

Índice de refracción: Relación entre la velocidad de la luz en el aire y su velocidad en el medio, las sustancias: Agua = 1.3300 Aceite de inmersión = 1.5150

Angulo de apertura: Es la capacidad de un objetivo de captar los rayos luminosos refractados cuando éstos atraviesan un medio transparente. Cuanto mayor sea este ángulo, la lente frontal del objetivo aceptará una mayor cantidad de ellos, dada fundamentalmente por la distancia que existe entre el objeto y el objetivo.

Dependiendo del índice de refracción del material transparente que forma la lente del condensador que exista entre el objeto y la lente frontal del objetivo, el ángulo de apertura será mayor o menor.

Los rayos luminosos que atraviesan el aire se refractan más y por lo tanto su desviación es mayor porque el índice de refracción del aire es igual a 1.0.

Apertura numérica (NA): Es una medida que indica la capacidad del objetivo de poder captar los rayos refractados por las estructuras finas de las cuales está constituido el objeto que se observa. Es el poder de formar imágenes que muestren al observador una serie de detalles del objeto que se está examinando.
Cuanto mayor sea la apertura numérica de un objetivo, éste tendrá una mayor capacidad de mostrar detalles finos en la imagen que forma.
La apertura numérica es directamente proporcional con el aumento propio del objetivo y con la capacidad que tiene de mostrar mayores detalles.
Por ejemplo en la relación de objetivos que se muestran se puede comprobar lo afirmado referente al aumento del microscopio: 4x 0.10, 10x 0.25, 40x 0.65, 100x 1.25oil.

Aumento de un objetivo. Es la capacidad que posee un objetivo de ampliar la imagen del objeto observado. Es la relación entre el tamaño de la imagen y el objeto.

Poder de resolución. La capacidad de un objetivo de poder distinguir la distancia mínima que debe existir entre dos puntos del objeto para que se puedan visualizar como dos puntos separados.
Calidad de una imagen, (claridad, nitidez y la riqueza de detalles).
Depende de la longitud de onda del rayo luminoso utilizado y la apertura numérica del sistema óptico del objetivo.
El máximo poder de resolución que se puede obtener es de 0.2 micrometros , para lo cual se requiere que el microscopio proporcione una imagen de un aumento total de 1000x.

3. Ocular:

Forma una segunda imagen a partir de la imagen primaria que forma el objetivo.
Esta imagen únicamente amplía un número determinado de veces (10x), a la imagen formada por el objetivo.

4. Prismas:

Estructuras transparentes que desvian los rayos luminosos de la trayectoria rectilínea del eje óptico del objetivo y dirigirlos hacia el tubo óptico ligeramente inclinado y luego hacia el ocular (monoculares). En los microscopios binoculares, separan los rayos luminosos provenientes del objetivo, en dos haces de luz y los dirigen a cada ocular.

TIPOS DE MICROSCOPIOS

FOTÓNICOS:

Microscopio de transparencia o de campo claro.

Emplea luz natural o luz artificial como energía luminosa para formar las imágenes del objeto que se observa. La imagen muestra puntos o áreas iluminadas (generalmente coloreados) sobre un fondo claro o transparente.
Para que la imagen sea visible con nitidez es necesario que el objeto examinado este coloreado o teñido, es decir que los componentes celulares y tisulares de la estructura se contrasten mediante colorantes específicos que absorban y transmitan determinadas longitudes de onda del espectro visible.
El campo microscópico aparece claro o transparente porque los rayos luminosos directos que provienen del condensador no encuentran en su camino ninguna estructura coloreada y entran como rayos de luz blanca hacia el objetivo.

Microscopio de campo oscuro.

Se denomina así por que la imagen que se forma está constituida por una serie de estructuras brillantes sobre un fondo oscuro.
Aprovechar un conjunto de rayos luminosos oblicuos que inicialmente no entran a la lente frontal del objetivo, observándose el campo microscopio totalmente oscuro. La apertura numérica del condensador es mayor que la apertura numérica del objetivo. Esta condición dirige rayos luminosos directos de la fuente luminosa sean impedidos de entrar a la porción central de la lente del condensador y solo penetren y emerjan de él, los rayos periféricos que al refractarse se hacen oblicuos.
Cuando estos rayos oblicuos encuentran en su recorrido, alguna partícula, son desviados hacia la lente frontal del objetivo y la imagen de la partícula se observa brillante en medio de un fondo oscuro..

MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES.

Es el microscopio fotónico más utilizado para observar objetos o estructuras transparentes sin teñir. Facilita la observación de células vivas para distinguir y analizar sus componentes morfológicos y ciertas funciones que ellas puedan desarrollar (fagocitosis, mitosis, movimientos ameboideos, ciliares o flagelares, etc.).

El principio óptico de este microscopio consiste en la capacidad que tiene para transformar, en los objetos transparentes, los pequeños índices de refracción que cada uno de sus componentes posee en diferencias de intensidad luminosa, ofreciendo imágenes donde las estructuras del objeto aparecen contrastadas en tonos oscuros o tonos brillantes y tonos intermedios.

MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA O DE RADIACIÓN ULTRAVIOLETA.

Ciertas sustancias naturales o artificiales poseen la propiedad que cuando son estimuladas por energía de cierta longitud de onda ( por ejemplo energía radiante invisible como la radiación ultravioleta o radiación luminosa violeta o azul) absorben esta energía y emiten fotones que integran ondas visibles de luz, de longitudes de onda siempre mayores que las ondas con las que fueron excitadas. Este fenómeno se denomina fluorescencia. La luz emitida se observa en forma de destellos coloreados sobre un fondo oscuro.

La condición esencial para que se produzca fluorescencia es que la longitud de onda de la energía radiante excitatoria sea menor que la longitud de onda emitida.

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN.

Tiene los mismos principios de un microscopio fotónico; en vez de usar energía luminosa, emplea haces de electrones y reemplaza las lentes de vidrio por “lentes” construidas con campos electromagnéticos. Los electrones que atraviesan o son desviados por estructuras del espécimen con escasa o nula densidad llegan a la pantalla fluorescente y estimulan sus partículas.

Aquellos electrones que inciden en estructuras de mayor densidad, son reflejados o absorbidos, no las atraviesan y dejan zonas de la pantalla sin estimular, por lo tanto en esos lugares no se emite luminosidad. Se emplea para obtener imágenes con un gran poder de resolución que alcanza desde 0.5 a 1.0 nanómetro.

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (SCANNING).

Funciona con los mismos principios electrónicos del M.E de transmisión. La diferencia estriba en que los electrones no atraviesan el espécimen para formar las imágenes.

Los electrones se aceleran y concentran hasta formar un haz sumamente delgado de mas o menos 5 nm de diámetro que rastrea o “barre” la superficie de la muestra.Los electrones se envían e inciden en la superficie de un detector localizado en las cercanías de la muestra, conectado a un amplificador que envía señales a la pantalla de un monitor de televisión. Para registrar la imagen formada se utiliza una cámara fotográfica.

El M.E. de barrido, tiene una resolución de 10 a 20 nm. El aumento efectivo es de 15,000 a 50,000 diámetros. Forma imágenes con una gran profundidad de foco, de 500 veces respecto al microscopio fotónico esto confiere a la imagen su aspecto tridimensional.

C) COMPONENTES DE ILUMINACIÓN:

Son los instrumentos que proporcionan energía luminosa al microscopio.

La luz natural, emitida por el sol, se obtiene de manera indirecta mediante un espejo que posee una superficie plana y otra cóncava.

La luz artificial se genera a través de una lámpara de bajo voltaje (generalmente de 6 voltios) que, mediante un reostato regula la emisión y la intensidad de luz. Al igual que el espejo, este sistema de iluminación se inserta en la base o pie del microscopio.

FILTROS.

Se sitúan entre la fuente luminosa y el condensador. Tienen por finalidad modificar la longitud de onda de la luz que ilumina el objeto a observar, son transparentes (de vidrio, plástico o gelatina) coloreadas que se localizan luz artificial es necesario emplear filtros azules pues modifican el color ligeramente amarillento que poseen los rayos luminosos que emite las lámparas eléctricas, transformándolos en rayos de luz “blanca”.

D) COMPONENTES ELÉCTRICOS

En este apartado se encuentra el botón regulador de iluminación que sirve de encendedor/apagador (reostato) y el cable de alimentación.